Биореактор внутри нас: как микробиота управляет метаболизмом хозяина

Со времен Пастера известно, что желудочно-кишечный тракт человека — это, по существу, биореактор проточного типа, в котором обитает множество микроорганизмов. Отношение ученых к микрофлоре кишечника за это время радикально изменилось. Лет сто назад великий Илья Мечников, основоположник современной теории иммунитета, за создание которой он получил Нобелевскую премию (на двоих со своим непримиримым оппонентом – не менее великим Паулем Эрлихом), предлагал даже удаление толстого кишечника как один из способов продления жизни. А тем, кому эта мера казалась слишком радикальной, рекомендовал пить как можно больше кефира, чтобы вытеснить вредных, по его мнению, микробов полезными лактобактериями. Через полвека курс изменился на 180 градусов. Оказалось, что нормальная микрофлора кишечника, а также кожи и слизистых оболочек выполняет множество полезных функций — например, подавляет жизнедеятельность постоянно атакующих организм патогенных микроорганизмов. А в последние годы самые смелые из микробиологов пошли еще дальше, объявив человека и его микробов единым симбиотическим сверхорганизмом.

Развитие методов молекулярной биологии вывело ученых на новый уровень понимания процессов симбиоза человека и его микрофлоры, которые казались хорошо изученными и от дальнейшего изучения которых не ждали особых сюрпризов. Стремительный рост скорости и падение стоимости методов секвенирования ДНК (определения ее нуклеотидной последовательности) и параллельный рост мощности персональных компьютеров и развитие интернета дали возможность анализировать информацию о крупных участках геномов. После того как были расшифрованы хромосомы сотен видов отдельных бактерий, в генетике микроорганизмов появился новый подход — популяционный: анализ генов сразу всех бактерий, населяющих определенный ареал. Разумеется, население «человеческого биореактора» оказалось одной из наиболее важных для изучения микробных популяций.

Первая работа, заставившая совершенно по-новому взглянуть на кишечную микробиоту, была опубликована в 1999 году группой ученых из Национального института агрономических исследований (Франция) и Университета Ридинга (Великобритания). Авторы решили применить для исследования микробной популяции кишечника метод секвенирования генов 16S РНК (см. врезку «16S PHK — удостоверение личности бактерии»).

Первый этап определения микроорганизмов — их культивирование на питательных средах. Но ряд микробов не желают расти ни на одной из сред. Изучать ранее недоступные некультивируемые бактерии и начать наводить порядок в донельзя запутанной систематике уже известных прокариот стало возможным с развитием биоинформатики и появлением современных методов молекулярной биологии – полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяющей из одного участка ДНК получить миллионы и миллиарды точных копий, клонирования выделенных с помощью ПЦР генов в бактериальных плазмидах и методик секвенирования последовательностей нуклеотидов, полученных в результате всего этого в достаточном для анализа количестве. Идеальным маркером для идентификации микроорганизмов оказался ген, кодирующий 16S рибосомальную РНК (каждая из двух субъединиц рибосом – клеточных мастерских по синтезу белка – состоит из переплетенных молекул белков и цепочек рибонуклеиновых кислот). Этот ген есть в геноме всех известных бактерий и архей, но отсутствует у эукариот и вирусов, и если вы нашли характерную для него последовательность нуклеотидов – вы точно имеете дело с генами прокариот. (Если быть очень точным, ген 16S РНК есть и у эукариот, но не в ядерных хромосомах, а в митохондриальных. Это еще раз подтверждает, что митохондрии – отдаленные потомки бактерий-симбионтов первых эукариотических организмов.) Этот ген имеет как консервативные участки, одинаковые у всех прокариот, так и видоспецифичные. Консервативные участки служат для первого этапа полимеразной цепной реакции – присоединения исследуемой ДНК к праймерам (затравочным участкам ДНК, к которым изучаемая цепочка нуклеотидов должна присоединиться для начала анализа остальной последовательности), а видоспецифичные – для определения видов. К тому же степень схожести видоспецифичных участков очень хорошо отражает эволюционное родство разных видов. Дополнительный бонус – для клонирования и последующего анализа можно использовать саму рибосомальную РНК, которая в любой клетке присутствует в гораздо большем количестве, чем соответствующий ей ген. Только надо сначала «переписать» ее в ДНК с помощью специального фермента – обратной транскриптазы. Нуклеотидные последовательности 16S РНК всех известных бактерий и архей (около 10 000 видов) общедоступны. Выявленные последовательности сравнивают с имеющимися в базах данных и точно идентифицируют вид бактерии или объявляют ее принадлежащей к очередному некультивируемому виду. В последнее время идет интенсивный пересмотр старой, фенотипической, классификации бактерий, основанной на плохо формализуемых критериях – от внешнего вида колоний до пищевых предпочтений и способности окрашиваться разными красителями. Новая систематика опирается на молекулярные критерии (16S РНК) и только отчасти повторяет фенотипическую.

Кодирующие последовательности 16S РНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) извлекали непосредственно из «окружающей среды» — 125 мг человеческого, извините, стула встраивали в плазмиды кишечной палочки (не потому, что она кишечная, а потому, что Escherichia coli — одна из любимых рабочих лошадок молекулярных биологов) и снова выделяли из культуры размножившихся бактерий. Таким образом была создана библиотека генов 16S РНК всех микроорганизмов, находившихся в образце. После этого случайным образом было отобрано и секвенировано 284 клона. Оказалось, что только 24% полученных последовательностей 16S РНК принадлежали известным ранее микроорганизмам. Три четверти микрофлоры, находящейся в кишечнике каждого человека, больше сотни лет избегали внимания исследователей, вооруженных методами классической микробиологии! Ученые просто не могли подобрать условия для культивирования этих бактерий, потому что самые капризные обитатели кишечника отказывались расти на традиционных микробиологических средах.