Мониторинг лечения пациентов с инфекцией, вызванной Mycoplasma genitalium с помощью методов ПЦР и НАСБД в реальном времени

К.б.н. А.Е. ГУЩИН 1 , врач О.А. БУРЦЕВ 2 , н.с. П.Г. РЫЖИХ 1 , д.м.н., проф. М.А. ГОМБЕРГ 3 , к.м.н. Г.А. ШИПУЛИН 1 1 НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора; 2 Государственный научный центр дерматовенерологии; 3 Московский государственный медико-стоматологический университет, Медсанчасть №7 ФМБА, Москва

Ключевые слова: негонококковые уретриты (НГУ), мониторинг, Mycoplasma genitalium, джозамицин, отлеляемое из уретры, первая порция мочи (ППМ), ПЦР, НАСБА в реальном времени.

Key words: non-gonococcal urethritis (NGU), monitoring, Mycoplasma genitalium, josamycin, urethral secretion, first portion of the urine sample, PCR, NASBA in real time.

В настоящее время накоплено достаточное количество клинико-эпидемиологических наблюдений и экспериментальных данных, свидетельствующих о самостоятельной этиопатогенетической роли Mycoplasma genitalium в развитии воспалительных заболеваний урогенитального тракта мужчин и женщин. В предыдущей работе мы показали, что инфекция, вызванная М. genitalium, протекает у мужчин в большинстве случаев в манифестной форме, сопровождаясь выраженными клиническими проявлениями и жалобами пациентов, обусловливая необходимость проведения лечебных мероприятий; при этом доля уретритов, вызванных М. Genitalium, составляет по разным данным от 15 до 30% среди НГУ [1]. Однако, как показали несколько исследований, существующие в настоящий момент схемы лечения негонококковых уретритов (НГУ), эффективные в отношении основного возбудителя НГУ - Chlamydia trachomatis, оказались менее эффективны в отношении М. genitalium. Лечение тетрациклиновыми препаратами пациентов с уретритом, вызванным М. genitalium, приводило к рецидиву инфекции в 63% случаев [2], а лечение азитромицином в дозировке и по протоколу лечения хламидийного уретрита не давало эффекта в 18-28% случаев [3, 4]. В связи с этим поиск альтернативных схем лечения является важнейшей практической задачей. Результаты исследований in vitro показывают, что наиболее эффективными препаратами в отношении М. genitalium являются макролиды и некоторые фторхинолоны, однако, как уже отмечалось выше на примере лечения азитромицином, полученные данные in vitro не могут автоматически переноситься на клиническую ситуацию. Объективная оценка эффективности препарата в отношении возбудителя основывается не только на данных по чувствительности клеточной культуры клинического изолята, получаемых in vitro, но и на основании клинического и микробиологического эффекта, получаемого при лечении пациентов. Широко используемый в клинической практике для лечения различных инфекций препарат джозамицин (вилъпрафен, Астеллас Фарма) по результатам in vitro имеет высокую активность и в отношении М. genitalium, и в предыдущей работе мы продемонстрировали первые результаты, отражающие его высокую эффективность при лечении пациентов с НГУ, вызванным М. genitalium [5]. В настоящем исследовании мы предложили оценивать эффективность протокола лечения джозамицином на основании результатов динамического наблюдения, клинических и лабораторных признаков уретрита, а также скорости элиминации возбудителя при выявлении генетического материала М. genitalium - ДНК и рибосомальных РНК (рРНК) непосредственно в процессе лечения.

Целью настоящего исследования явилось изучение динамики элиминации М. genitalium у мужчин с уретритом в процессе терапии джозамицином с использованием методов полимеразной цепной реакции (ПЦР) и НАСБА (Nucleic Acids Sequence-Based Amplification).

Материал и методы

Пациенты. В Научно-консультативном диагностическом отделении ГНЦД Росмедтехнологий за период с декабря 2006 г. по декабрь 2008 г. были обследованы 344 пациента мужского пола в возрасте от 18 до 66 лет, обратившихся с жалобами по поводу выделений из мочеиспускательного канала и дизурических явлений или для обследования в связи с имевшимся незадолго до визита в клинику половым контактом с непостоянным партнером. При обследовании пациентов проводили сбор и анализ урологического анамнеза и анамнеза половой жизни, визуальную оценку состояния кожных покровов и слизистых оболочек органов мочеполовой системы, наличие и характер выделений из уретры.

В соответствии с установленными в Центре процедурами и нормативными документами всем пациентам назначали обычные лабораторные исследования, направленные на установление лабораторных признаков уретрита (наличие более 4 лейкоцитов в поле зрения при микроскопическом исследовании с 1000-кратном увеличением не менее чем 5 полей зрения препарата, окрашенного по Граму) и выявления возбудителей инфекций, передаваемых половым путем (ИППП) - Neisseria gonorrhoeae, С. trachomatis, Trichomonas vaginalis, а также M. genitalium. В случае обнаружения возбудителей ИППП лечение назначали в зависимости от этиологии инфекции.

Лечение пациентов с инфекцией, вызванной М. genitalium. Пациентам с инфекцией, вызванной М. genitalium, назначали джозамицин (вилъпрафен, Астеллас Фарма) в дозе 500 мг З раза в день в течение 10 дней. После окончания лечения пациентам предлагалось пройти клинический и лабораторный контроль на 28-30-й день после окончания терапии.

Мониторинг лечения пациентов с инфекцией, вызванной М. genitalium. Пациентам, у которых при скрининге была обнаружена М. genitalium и которые удовлетворяли другим критериям включения (см. ниже), было предложено принять участие в наблюдательном исследовании, направленном на изучение динамики клинических и лабораторных показателей инфекции в процессе терапии джозамицином, а также сразу после окончания терапии. Мониторинг эффективности лечения проводили согласно схеме, отраженной на рисунке. Всех пациентов, включенных в протокол мониторинга, приглашали к врачу непосредственно перед началом лечения, в процессе терапии - на 3-й и 8-й дни лечения (3 д/л и 8 д/л), а также на 2-й и 28-й дни после лечения (2 д/пл и 28 д/пл). Во время визитов у пациентов оценивали наличие жалоб и клинических проявлений инфекции, а также проводили лабораторные исследования В день визита пациентам было предложено собрать первую порцию утренней мочи в объеме 10-20 мл. На приеме у пациента получали отделяемое из уретры для микроскопического исследования и исследования молекулярно-биологическими методами.

Критерии включения. Критериями включения в протокол исследования являлись: М. genitalium; - отсутствие гонококковой, трихомонадной и герпетической инфекций; - отсутствие клинических признаков осложнений урогенитальной инфекции: уретропростатита, везикулита, орхоэпидидимита.

Оценка эффективности лечения и элиминации М. genitalium. Критерием эффективного лечения уретрита, вызванного М. genitalium, явилось: - отсутствие субъективных и объективных признаков уретрита; - количественное содержание лейкоцитов при микроскопическом исследовании менее 4 в поле зрения при исследовании не менее 5 полей зрения; - отсутствие ДНК и рРНК М.genitаliит при исследовании с помощью методов ПЦР и НАСБА в реальном времени двух типов клинического материала-первой порции утренней мочи (ППМ) и отделяемого из уретры.

Методы ПЦР и НАСБА, используемые в мониторинге терапии. Мониторинг терапии проводился в ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора с использованием наборов реагентов для ПЦР с детекцией в реальном времени "Амплисенс Mycoplasma genitalium-FRT" и наборов реагентов для реакции транскрипционной амплификации НАСБА в реальном времени "Амплисенс Mycoplasma genitalium-РИБОТЕСТ" согласно инструкциям к указанным тест-системам.

Результаты

В процессе клинико-лабораторного обследования диагноз НГУ был установлен у 242 пациентов. Среди них инфекция, вызванная М. genitalium, была выявлена у 51 (21%) пациента. Подробная характеристика клинических проявлений большей части обследованных пациентов представлена в нашей предыдущей работе [5].

Рисунок. Мониторинг результатов лечения джозамицином (вильпрафеном).

М. genitalium, была назначена соответствующая терапия джозамицином. Данные по контролю результатов терапии были получены у 49 пациентов, которые и составили группу оценки клинической и микробиологической эффективности; 2 пациента из 51 не явились на контрольное обследование.

В протоколе мониторинга эффективности лечения, график и процедуры которого представлены на рисунке, согласились принять участие 46 пациентов М. genitalium.

В указанной группе пациентов до начала терапии у 6 человек отсутствовали жалобы и клинические проявления инфекции, из них у 2 отсутствовали и лабораторные признаки уретрита. Еще у одного пациента в отсутствие лейкоцитов в отделяемом из уретры имелись жалобы на боль при мочеиспускании.

В общем виде результаты мониторинга представлены в табл. 1.

Таблица 1. Динамика выявления клинических и лабораторных маркеров уретрита и генетических маркеров М. genitalium у 46 пациентов в процессе терапии джозамицином

Период исследования Наличие ДНК и/или рРНК М. genitalium Наличие клинических признаков уретрита Наличие лабораторных признаков уретритаДо печения 46 (100%) 40 (100%) 43 (100%)3 д/л 33 (71,7%) 26 (65%) 32 (74,4%)8 д/л 14 (30,4%) 10 (25%) 28 (65%)2 д/пл 6 (13%) 4 (10%) 17 (39,5%)28 д/пл 3 (6,5%) 2 (5%) 2 (4,6%)

Следует отметить достаточно быструю нормализацию клинического статуса пациентов на фоне лечения джозамицином. К 3-му дню лечения у более 1/3 пациентов исчезли субъективные признаки инфекции, остальные пациенты (за исключением 2) отметили положительную динамику лечения и уменьшение выраженности симптомов инфекции по сравнению периодом до начала терапии. К 8-му дню лечения те или иные субъективные ощущения и слабые клинические признаки уретрита остались только у 10 (25%) пациентов. На 2-йдень после окончания терапии отмечались жалобы на незначительный зуд и дискомфорт в уретре у оставшихся 4 пациентов.

Наиболее поздним маркером инфекционно-воспалительного процесса оказался уровень лейкоцитов в отделяемом из уретры. На 2-й день после окончания лечения повышенное содержание лейкоцитов наблюдалось у 17(39,5%) человек. Однако в течение последующего периода наблюдения у всех, за исключением 2 пациентов, микроскопическая картина пришла в норму.

Для контрольного обследования на 28-й день после лечения пришли только 12 пациентов - те, у кого на 2-й день после лечения имелись повышенные уровни лейкоцитов в отделяемом из уретры. К 28-му дню ни клинических, ни лабораторных признаков уретрита, а также наличия генетических маркеров М. genitalium у них обнаружено не было.

До начала терапии, как показали результаты исследования, наличие нуклеиновых кислот М. genitalium было подтверждено у всех 46 пациентов, принявших участие в исследовании. При этом у всех указанных пациентов нуклеиновые кислоты возбудителя обнаруживались как в отделяемом из уретры, так и в ППМ. Результаты по динамике микробиологического ответа, представленные в табл. 1, свидетельствовали, что примерно у 1/3 пациентов элиминация нуклеиновых кислот М. genitalium происходит к 3-му дню терапии, а к 8-му дню лечения маркеры М. genitalium отсутствовали у 77% пациентов. На 2-й день после окончания лечения только у 6 (13%) пациентов определялись нуклеиновые кислоты возбудителя.

Результаты оценки динамики элиминации ДНК и рРНК М. genitalium в разных типах клинического материала представлена в табл. 2. Следует отметить, что до начала лечения в обоих типах клинического материала - и в отделяемом из уретры, и в ППМ - обнаруживались оба типа нуклеиновых кислот М. genitalium. В процессе лечения на разных сроках оказалась высокая доля пациентов, у которых нуклеиновые кислоты обнаруживаются только в каком-то одном типе клинического материала - либо в отделяемом из уретры, либо в ППМ. Среди пациентов, ответивших на лечение, оказалась высокой доля тех, у кого в ППМ продолжала выявляться ДНК, в то время как при тестировании отделяемого из уретры результаты ПЦР были отрицательными.

Таблица 2. Результаты сравнения частоты выявления ДНК и рРНК М.genitalium в разных типах клинического материала - соскобе из уретры и ППМ - на разных сроках лечения джозамицином

Период исследования и число пациентов М. genitalium, результаты ПЦР рРНК М. genitalium (НАСБА) У: "ДНК-" ППМ "ДНК+" У.: "ДНК+" ППМ: "ДНК-" У: "ДНК+" ППМ: "ДНК+" У: "ДНК+" ППМ "ДНК+" У: "ДНК+" ППМ "ДНК-" У: "ДНК ->ППМ:" "ДНК+" До лечения 46 (100%) 46 (100%) 0 0 46 (100%) 0 03 д/л 33 (100%) 18 (54,5%) 4 (12%) 8 (24,2%) 25 (75%) 2 (6%) 6 (18%)8 д/л 14 (100%) 2 (14%) 2 (14%) 8 (57%) 6 (43%) 3 (21%) 3(21%)2 д/пл 6 (100%) 2 (33%) 2 (33%) 2 (33%) 3 (50%) 2 (33%) 1 (16%)28 д/пл 3 (6,5%) 2 0 0 3 0 0

Общий анализ динамики клинических, лабораторных и генетических маркеров инфекции, вызванной М. genitalium, позволил установить, что из 49 пациентов, включенных в исследование, клинический и микробиологический эффект был достигнут у 46. Рецидив инфекции был установлен у 3 пациентов на разных сроках после окончания терапии: от 2 до 14 дней. В эти сроки у пациентов возобновились жалобы, сопровождающиеся выделениями из уретры и повышением уровня лейкоцитов в отделяемом из уретры. Молекулярно-биологический анализ также подтвердил наличие нуклеиновых кислот М. genitalium.

В процессе анализа неудачи терапии 3 пациентам было назначено исследование секрета предстательной железы и УЗИ, которые позволили выявить у одного из них признаки простатита. В настоящее время мы не можем исключить простатит и у других инфицированных лиц на момент назначения терапии, тем не менее мы сочли правильным исключить из анализа оценки эффективности препарата указанного пациента и ограничиться только анализом результатов по пациентам с неосложненными формами инфекции, ассоциированной с М. genitalium. В результате клиническая и микробиологическая эффективность терапии джозамицином составила 46/48 (95,8%).

Обсуждение

В своей работе мы впервые в практике лабораторного исследования на М. genitalium предложили достаточно строгую микробиологическую оценку эффективности лечения - исследовали оба типа нуклеиновых кислот возбудителя и 2 типа клинического материала. Обнаружение какого-либо из маркеров М. genitalium (ДНК или рРНК) в отделяемом из уретры или моче мы рассматривали в пользу имеющейся инфекции.

Целесообразность такого подхода основана на следующем. Оба метода ПЦР и НАСБА обладают максимально высокой чувствительностью и специфичностью при диагностике ряда инфекций в целом и для выявления М. genitalium в частности. В то же время НАСБА имеет существенное отличие от ПЦР: в качестве мишени используются одноцепочечные молекулы рРНК В этом случае исходное количество мишеней для НАСБА в сотни и тысячи раз больше, чем для ПЦР, что позволяет рассчитывать на более высокую аналитическую чувствительность. В рамках разработки и лабораторных испытаний нами было установлено, что с помощью НАСБА можно было обнаружить возбудитель как минимум в 10 раз меньшей концентрации, чем методом ПЦР. В нашем исследовании именно методом НАСБА удалось подтвердить наличие возбудителя у одного из пациентов с рецидивом инфекции, у которого плотность обсемененности М. genitalium была столь низка, что не обнаруживалась методом ПЦР.

Вторым важным обстоятельством является то, что РНК, как хорошо известно, в отличие от ДНК являются менее стабильными молекулами и значительно быстрее разрушаются при гибели клеток, в том числе под действием антибактериальных препаратов. Это дает основание рассматривать положительные результаты НАСБА как более точный маркер наличия инфекции, по крайней мере, при лечении. В работе [6] было показано, что при лечении пациентов с С. trachomatis доксициклином ДНК возбудителя обнаруживалась на 2 нед позже после элиминации РНК Наши исследования позволили выявить у определенной группы пациентов на 3-й и 8-й день лечения рРНК, определяющуюся в том случае отрицательного анализа на ДНК возбудителя. Однако в нашем случае общая скорость элиминации нуклеиновых кислот была высокой, и уже на ранних сроках после лечения возбудитель не обнаруживался, что демонстрирует высокий антибактериальный эффект джозамицина.

Второй важной особенностью нашей работы было исследование двух типов клинического материала - отделяемого из уретры - основного вида клинического материала, исследуемого у мужчин в нашей стране при диагностике урогенитальных инфекций, и ППМ. Основанием для включения ППМ в исследование послужила работа [7], в которой на значительном клиническом материале было продемонстрировано, что при первичном обследовании пациентов на М. genitalium исследование ППМ позволило выявить большее число инфицированных В нашем исследовании у всех пациентов до начала лечения обоими методами (ПЦР и НАСБА) были получены положительные результаты как в соскобном отделяемом из уретры, так и в моче, а в процессе терапии число пациентов с отрицательными результатами ПЦР и НАСБА в соскобе и положительными в моче было выше, чем число тех, у кого нуклеиновые кислоты обнаруживались в соскобе и не обнаруживались в ППМ.

На основании полученных данных можно сделать вывод, что в случае диагностики М. genitalium идеальным вариантом является исследование обоих типов клинического материала; если все же предстоит делать выбор в пользу одного из материалов, то ППМ следует рассматривать как имеющий предпочтение. Однако при этом необходимо отметить, что обязательным условием является высокая аналитическая чувствительность молекулярного теста для ППМ, поскольку в моче содержится большее, чем в соскобе, количество ингибиторов ПЦР, требующее высокоэффективных методик экстракции нуклеиновых кислот. Тест-системы, которые мы использовали в своей работе, как раз и соответствовали этим требованиям.

Полученные результаты объективно отражают высокую эффективность джозамицина при лечении инфекции, вызванной М. genitalium, исходя из высокой скорости элиминации возбудителя в процессе лечения. Из 48 пациентов с неосложненной инфекцией, вызванной М. genitalium, клинический и микробиологический ответ был получен у 46 (95,8%).